PYK2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400708-ACT

PTK2B kodiert die nichtrezeptorartige Tyrosinkinase PYK2 (Protein-Tyrosinkinase 2 beta), einen Ca2+- und integrin-reaktiven Signalhub, der extrazelluläre Reize mit Zytoskelett-Umbau und Genexpression verknüpft. PYK2 ist an Signalwegen der fokalen Adhäsion und der Aktin-Dynamik beteiligt und interagiert mit Src-Familien-Kinasen, der MAPK/ERK-Signalkaskade sowie nachgeschalteten Transkriptionsprogrammen, die Adhäsion, Migration und Entzündungsreaktionen regulieren. In Immun- und myeloischen Zelllinien moduliert PYK2 chemokin- und zytokinvermittelte Signalübertragung und trägt zur angeborenen Immunaktivierung sowie zum Leukozyten-Trafficking bei. Eine Fehlregulation der PTK2B/PYK2-Signalgebung wurde mit neuroinflammatorischen und neurodegenerativen Mechanismen, autoimmunassoziierten Signalnetzwerken und Kontexten der Tumorzellinvasion in Verbindung gebracht, wodurch sie ein nützliches Ziel für Studien zur Störung/Modulation von Signalwegen darstellt.

PYK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTK2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PYK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTK2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTK2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PYK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTK2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PYK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PYK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTK2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.