Purα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403760-ACT

PURA kodiert Purα, ein sequenzspezifisches, einzelsträngige DNA- und RNA-bindendes Protein, das die transkriptionelle Regulation, die DNA-Replikation sowie den Transport und die Translation von mRNA koordiniert. Purα ist an der Kontrolle des Zellzyklus und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt und ist besonders in neuronalen Kontexten angereichert, wo es die Dynamik von RNA-Granula und die synaptische Funktion beeinflusst. Eine Fehlregulation von PURA wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und veränderter neuronaler Erregbarkeit in Verbindung gebracht, und ein Purα-abhängiger RNA-Stoffwechsel verknüpft diesen Faktor mit übergeordneten Signalwegen, die die Proteinsynthese und Stressantworten steuern. Diese Eigenschaften machen PURA zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung von Genexpressionsprogrammen und RNA-Protein-Interaktionen, die für die Biologie des Nervensystems relevant sind.

Purα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PURA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Purα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PURA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PURA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Purα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PURA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Purα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Purα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PURA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.