PiT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403121-ACT

SLC20A1 kodiert PiT1 (SLC20A1), einen natriumabhängigen Transporter für anorganisches Phosphat (Pi) an der Plasmamembran, der die Phosphataufnahme unterstützt, die für die Nukleotidsynthese, den Phospholipidstoffwechsel und die ATP-abhängige Bioenergetik erforderlich ist. Über seine Transportfunktion hinaus trägt PiT1 zur Kontrolle des Zellwachstums und zur Nährstoffsensorik bei, indem er die extrazelluläre Phosphatverfügbarkeit mit intrazellulären Stoffwechselprogrammen und dem Fortschreiten des Zellzyklus verknüpft. Veränderte SLC20A1-Expression wurde in Zusammenhängen einer gestörten Phosphathomöostase, aberranter Proliferation und von Stressantworten untersucht, bei denen Pi-Flüsse Signalnetzwerke und verkalkungsassoziierte Prozesse beeinflussen können. Als breit exprimierter humaner Transporter ist PiT1 ein nützlicher Ansatzpunkt, um die phosphatabhängige Regulation von Stoffwechsel und Genexpression in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen.

PiT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC20A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PiT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC20A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC20A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PiT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC20A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PiT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PiT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC20A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.