Plásmido CRISPR de Activación (h) PIRT: sc-416125-ACT

PIRT humano (regulador de canales TRP que interactúa con fosfoinosítidos) codifica una pequeña proteína asociada a la membrana que se une al fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) y modula la actividad de determinados canales iónicos del potencial receptor transitorio (TRP). Mediante la regulación del flujo de calcio y de otros cationes dependiente de TRP, PIRT contribuye a procesos de señalización sensorial, como la nocicepción, la termosensación y el prurito, vinculando la dinámica de los fosfoinosítidos de membrana con la excitabilidad neuronal. La señalización asociada a PIRT converge con vías que controlan la compuerta de los canales mediada por GPCR y por lípidos, lo que afecta a respuestas posteriores de segundos mensajeros y a programas de transcripción dependientes de la actividad. Las alteraciones en la regulación de los canales TRP y en la señalización de fosfoinosítidos se han implicado en fenotipos de dolor y neuroinflamación, lo que convierte a PIRT en un nodo útil para estudios mecanísticos en biología de neuronas sensoriales y en modelos de enfermedad relacionados.

PIRT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PIRT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PIRT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PIRT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PIRT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PIRT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PIRT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PIRT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PIRT en células tumorales con expresión de PIRT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.