Perlecan CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400823-ACT

HSPG2 kodiert Perlecan, ein großes Heparansulfat-Proteoglykan der Basalmembranen und perizellulären Matrizes, das die Architektur der extrazellulären Matrix organisiert und die Bioverfügbarkeit von Wachstumsfaktoren moduliert. Durch die Bindung von FGF, VEGF, PDGF und anderen Liganden über seine Glykosaminoglykan-Ketten und Domänen des Kernproteins beeinflusst Perlecan die Zelladhäsion, die Mechanotransduktion sowie Signalwege, die Proliferation, Migration und angiogene Antworten regulieren. Perlecan trägt außerdem zur Homöostase von Knorpel und Gefäßen bei, indem es Interaktionen zwischen Lamininen, Kollagenen und Integrinen koordiniert und so Barrierefunktion und Gewebewiderstandsfähigkeit mitprägt. Eine dysregulierte HSPG2-Expression oder eine veränderte Perlecan-Struktur ist mit entwicklungsbedingten skelettalen Phänotypen, dem Remodeling des Tumormikromilieus und vaskulären Pathologien assoziiert, was HSPG2 für die Erforschung ECM-getriebener Krankheitsmechanismen relevant macht.

Perlecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Perlecan Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Perlecan-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Perlecan-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Perlecan-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.