PDI Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400676-ACT

O gene humano P4HB codifica a isomerase de dissulfeto de proteína (PDI), uma oxidorredutase tiol–dissulfeto e chaperona residente no RE que catalisa a formação, a redução e a isomerização de pontes dissulfeto para dar suporte ao dobramento oxidativo de proteínas. A PDI é um componente central das redes de proteostase do retículo endoplasmático, contribuindo para a sinalização da resposta a proteínas mal dobradas (UPR), para a degradação associada ao RE (ERAD) e para o controle de qualidade de proteínas secretoras e de membrana. Por meio de suas funções na homeostase redox e na atividade de chaperona, a PDI influencia as respostas celulares ao estresse oxidativo, à hipóxia e a perturbações metabólicas que se cruzam com vias de inflamação e sobrevivência. A atividade desregulada de P4HB/PDI e sua expressão elevada são frequentemente estudadas em contextos de estresse proteotóxico e biologia tumoral, bem como em neurodegeneração e remodelamento fibrótico, nos quais vias de estresse do RE estão implicadas.

PDI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P4HB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P4HB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P4HB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P4HB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDI em células tumorais com expressão de P4HB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.