Plásmido CRISPR de Activación (h) PDI: sc-400676-ACT

El gen humano **P4HB** codifica la **isomerasa de disulfuro de proteínas (PDI)**, una oxidorreductasa tiol–disulfuro y chaperona residente del RE que cataliza la formación, reducción e isomerización de enlaces disulfuro para apoyar el plegamiento oxidativo de proteínas. La PDI es un componente central de las redes de proteostasis del retículo endoplásmico, y contribuye a la señalización de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), a la degradación asociada al RE (ERAD) y al control de calidad de proteínas secretoras y de membrana. A través de sus funciones en la homeostasis redox y su actividad de chaperona, la PDI influye en las respuestas celulares al estrés oxidativo, la hipoxia y las alteraciones metabólicas que convergen con vías de inflamación y supervivencia. La actividad desregulada de P4HB/PDI y su expresión elevada se estudian con frecuencia en contextos de estrés proteotóxico y biología tumoral, así como en neurodegeneración y remodelado fibrótico, donde están implicadas las vías de estrés del RE.

PDI El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de P4HB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PDI El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus P4HB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional P4HB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PDI. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo P4HB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PDI en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PDI en células tumorales con expresión de P4HB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.