Plasmide CRISPR d'Activation (h) PCCA: sc-404791-ACT

PCCA code la sous-unité alpha de la propionyl‑CoA carboxylase, une enzyme mitochondriale biotino‑dépendante qui catalyse la conversion, dépendante de l’ATP, du propionyl‑CoA en D‑méthylmalonyl‑CoA. Cette réaction est essentielle au catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée, des acides gras à nombre impair de carbones et des chaînes latérales du cholestérol, reliant l’utilisation des acides aminés et des lipides à l’anaplérose mitochondriale et au métabolisme énergétique. La fonction de PCCA s’inscrit à l’interface du métabolisme de la biotine, de l’homéostasie des protéines mitochondriales et des réponses au stress métabolique qui influencent l’équilibre redox et la gestion des acides organiques. Une altération pathogène de l’activité de PCCA est associée à l’acidémie propionique, ce qui en fait une cible utile pour étudier le dysfonctionnement métabolique, la signalisation du stress mitochondrial et les relations génotype–phénotype dans des modèles cellulaires humains.

PCCA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCCA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCCA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCCA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCCA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCCA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCCA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCCA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCCA dans les cellules tumorales présentant une expression de PCCA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.