Plásmido CRISPR de Activación (h) PAPD1: sc-412459-ACT

MTPAP codifica la polimerasa mitocondrial de poli(A) PAPD1, una enzima de procesamiento de ARN que añade colas poli(A) a los ARNm mitocondriales para favorecer la estabilidad de los transcritos, su maduración y una traducción mitocondrial eficiente. A través de su papel en la expresión génica mitocondrial, PAPD1 contribuye a la capacidad de fosforilación oxidativa, a la homeostasis de la cadena respiratoria y a programas más amplios de control de calidad mitocondrial. La desregulación de la poliadenilación del ARN mitocondrial puede alterar el metabolismo energético y amplificar respuestas de estrés celular asociadas a fenotipos neuromusculares y neurodegenerativos. Por ello, MTPAP/PAPD1 se estudia con frecuencia en vías que conectan la biología del ARN mitocondrial con la bioenergética, la proteostasis y la supervivencia celular bajo estrés metabólico.

PAPD1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MTPAP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PAPD1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MTPAP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MTPAP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PAPD1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MTPAP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PAPD1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PAPD1 en células tumorales con expresión de MTPAP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.