Plásmido CRISPR de Activación (h) p16-ARC: sc-403469-ACT

ARPC5 humano codifica p16-ARC, una subunidad central del complejo Arp2/3 que nuclea filamentos de actina ramificados para controlar la formación de lamelipodios, la polaridad celular, la endocitosis y el tráfico vesicular. Mediante la regulación de la remodelación de la actina aguas abajo de las GTPasas de la familia Rho, la actividad de Arp2/3 coordina el recambio de adhesiones y la migración direccional, modelando la dinámica del citoesqueleto durante la proliferación y la diferenciación. Las alteraciones en la función del complejo Arp2/3 y en la organización de la red de actina se han vinculado con fenotipos invasivos y comportamiento metastásico en múltiples contextos de cáncer, así como con defectos más amplios en el tráfico de membrana y la motilidad de células inmunitarias. Por ello, ARPC5 es un nodo útil para estudiar la señalización dependiente del citoesqueleto, la mecanotransducción y los cambios en el movimiento celular impulsados por el microambiente.

p16-ARC El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARPC5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

p16-ARC El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARPC5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARPC5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de p16-ARC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARPC5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de p16-ARC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía p16-ARC en células tumorales con expresión de ARPC5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.