p115 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403918-ACT

USO1 codifica o fator de ancoragem de vesículas p115, uma proteína conservada de hélice enrolada (coiled-coil) que coordena o transporte do RE para o Golgi e o transporte intra-Golgi ao fazer a ponte entre os revestimentos vesiculares, componentes da matriz do Golgi e a maquinaria de SNAREs. A p115 contribui para a manutenção da estrutura do Golgi, do tráfego direcional de membranas e da homeostase da via secretora, influenciando assim o processamento de proteínas e a sua entrega à superfície celular. A perturbação do tráfego associado a USO1 pode afetar a proteostase, respostas ao stress e saídas de sinalização que dependem de secreção regulada e da renovação de recetores de membrana. O transporte vesicular desregulado e a desorganização do Golgi estão frequentemente associados à transformação oncogénica e a fenótipos neurodegenerativos, tornando o USO1 um nó útil para estudar as consequências, ao nível de vias, da disfunção secretora.

p115 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de USO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p115 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus USO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição USO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p115. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus USO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p115 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p115 em células tumorais com expressão de USO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.