p107 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400779-ACT

Humanes RBL1 kodiert das retinoblastomähnliche Protein p107, ein Pocket-Protein, das den Zellzyklusfortschritt durch Bindung von E2F-Transkriptionsfaktoren hemmt und die Repression von Genen koordiniert, die für den Eintritt in die S‑Phase erforderlich sind. p107 integriert Signale der Cyclin-abhängigen Kinaseaktivität und ist an RB/E2F- sowie checkpoint-assoziierten Signalwegen beteiligt, die proliferative Signale mit der transkriptionellen Kontrolle koppeln. Über Interaktionen mit Chromatinregulatoren und Programmen der DNA-Replikation trägt p107 zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und von Differenzierungszuständen bei. Eine veränderte Aktivität des RBL1-Signalwegs ist mit dysregulierter Proliferation assoziiert und wird häufig im Kontext onkogener Zellzykluskontrolle und Störungen von Tumorsuppressor-Netzwerken untersucht.

p107 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p107 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p107-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p107-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p107-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.