OTC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402611-ACT

A transcarbamilase da ornitina (OTC) é uma enzima mitocondrial que catalisa a conversão de ornitina e fosfato de carbamoíla em citrulina, uma etapa central do ciclo da ureia hepático responsável pela desintoxicação da amônia. Ao regular a eliminação de nitrogênio, a atividade da OTC influencia o balanço de nitrogênio celular, o metabolismo mitocondrial e a homeostase de aminoácidos, com efeitos downstream sobre o estresse oxidativo e o estado bioenergético. A desregulação da OTC está associada à hiperamonemia e a erros inatos do metabolismo, e alterações no fluxo do ciclo da ureia têm sido estudadas em contextos de reprogramação metabólica e disfunção mitocondrial. Assim, a OTC humana serve como um nó útil para dissecar o controle do ciclo da ureia, o manejo de nitrogênio e as respostas ao estresse associadas às mitocôndrias em hepatócitos e em sistemas modelo relevantes para o fígado.

OTC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OTC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OTC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OTC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OTC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OTC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OTC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OTC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OTC em células tumorais com expressão de OTC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.