Plasmide CRISPR d'Activation (h) OPG/Osteoprotegerin: sc-400497-ACT

TNFRSF11B code l’ostéoprotégérine (OPG), un récepteur leurre sécrété de la superfamille des récepteurs du TNF qui se lie à RANKL (TNFSF11) et limite la signalisation RANK–RANKL, modulant ainsi la différenciation des ostéoclastes et le remodelage osseux. En séquestrant RANKL et des ligands apparentés, l’OPG influence l’activation en aval des voies NF-κB et MAPK dans les précurseurs ostéoclastiques et contribue au couplage entre l’activité des ostéoblastes et celle des ostéoclastes. Au-delà de la biologie squelettique, l’OPG a été impliquée dans des processus vasculaires et immunitaires via la régulation de la signalisation des cytokines et des signaux issus du microenvironnement extracellulaire. Une expression dérégulée de TNFRSF11B/OPG est associée à des phénotypes de remodelage osseux altéré et a été étudiée dans des contextes incluant l’ostéoporose, les mécanismes des maladies ostéolytiques et la physiopathologie liée aux calcifications.

OPG/Osteoprotegerin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNFRSF11B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OPG/Osteoprotegerin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNFRSF11B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNFRSF11B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OPG/Osteoprotegerin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNFRSF11B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OPG/Osteoprotegerin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OPG/Osteoprotegerin dans les cellules tumorales présentant une expression de TNFRSF11B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.