O-GlcNAc transferase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400717-ACT

O OGT humano codifica a O-GlcNAc transferase, a enzima central que catalisa a modificação O‑ligada por β‑N‑acetilglucosamina (O‑GlcNAc) em resíduos de serina/treonina de proteínas nucleares e citoplasmáticas. Esta modificação pós-traducional dinâmica integra a deteção de nutrientes pela via biossintética das hexosaminas com a regulação transcricional, a remodelação da cromatina, o controlo do ciclo celular e a sinalização de resposta ao stress. A O‑GlcNAcilação dependente de OGT modula reguladores-chave, incluindo a RNA polimerase II, c‑Myc, p53 e NF‑κB, moldando a proteostase e a comunicação cruzada de sinalização com a fosforilação. A atividade desregulada de OGT e a ciclagem global de O‑GlcNAc têm sido associadas à biologia do cancro, disfunção metabólica, neurodegeneração e alterações na sinalização imunitária, sustentando a sua ampla relevância para estudos mecanísticos.

O-GlcNAc transferase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OGT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

O-GlcNAc transferase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OGT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OGT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de O-GlcNAc transferase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OGT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de O-GlcNAc transferase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via O-GlcNAc transferase em células tumorais com expressão de OGT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.