NPAT CRISPR Activation Plasmid (m): sc-434105-ACT

Das Mausgen *Npat* kodiert NPAT, einen nukleären Kofaktor, der die Zellzyklusprogression mit der Transkription von Histon-Genen und der Chromatindynamik verknüpft. NPAT wird nachgeschaltet von Cyclin E/CDK2 aktiviert und lokalisiert in Histon-Locus-Körperchen, wo es die S‑Phasen-gekoppelte Expression replikationsabhängiger Histone unterstützt und DNA-Replikation sowie Genomerhalt koordiniert. Durch diese Funktionen trägt NPAT zu Signalwegen bei, die den G1/S‑Übergang, den Nukleotideinbau und den Chromatinaufbau steuern – Prozesse, die bei proliferativem Stress und krankheitsassoziierten Veränderungen von Zellzuständen häufig gestört sind. Die Modulation der *Npat*-Expression ist daher nützlich, um zu untersuchen, wie Zellzyklus-Signale mit Transkriptionsprogrammen zusammenwirken, die die Genomstabilität kontrollieren.

NPAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Npat-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Npat-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Npat-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPAT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Npat-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPAT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPAT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Npat-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.