NPAS4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402373-ACT

A NPAS4 humana (proteína 4 do domínio PAS neuronal) é um fator de transcrição bHLH-PAS (basic helix–loop–helix PAS) dependente de atividade que conecta a despolarização neuronal e a sinalização de cálcio a programas transcricionais rápidos. Ela regula o equilíbrio excitatório–inibitório ao modular o desenvolvimento e a plasticidade das sinapses, integrando entradas de vias associadas a CREB e MAPK para remodelar redes gênicas responsivas a estímulos. A NPAS4 influencia o remodelamento de circuitos neuronais, a dinâmica de espinhas dendríticas e a transcrição responsiva ao estresse, tornando-se um nó-chave na plasticidade dependente de experiência. A expressão desregulada de NPAS4 e de seus alvos a jusante tem sido associada a fenótipos neuropsiquiátricos e do neurodesenvolvimento, incluindo alterações cognitivas e maior suscetibilidade a mudanças de sinalização relacionadas a crises epilépticas e ao estresse.

NPAS4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPAS4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPAS4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPAS4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPAS4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPAS4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPAS4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPAS4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPAS4 em células tumorais com expressão de NPAS4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.