Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nkx-6.2: sc-403584-ACT

NKX6-2 code le facteur de transcription à homéoboîte Nkx-6.2, un régulateur se liant à l’ADN de manière spécifique à la séquence, qui contribue au contrôle de l’engagement de lignée et des programmes de maturation dans le système nerveux central en développement. L’activité de Nkx-6.2 s’intègre aux réseaux de régionalisation et de différenciation neurales en modulant des cascades transcriptionnelles qui orientent les décisions de destin cellulaire et l’expression génique en aval. En biologie humaine, une régulation altérée de NKX6-2 est pertinente pour l’étude des processus neurodéveloppementaux et des programmes génétiques associés à la myélinisation, où un câblage transcriptionnel aberrant peut perturber les états de maturation des neurones et des cellules gliales. En tant que régulateur transcriptionnel nucléaire, Nkx-6.2 est fréquemment étudié dans le cadre de la cartographie de voies, de la chronologie du développement et des analyses de réseaux régulateurs reliant l’occupation des promoteurs/activateurs (enhancers) au phénotype.

Nkx-6.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NKX6-2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nkx-6.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NKX6-2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NKX6-2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nkx-6.2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NKX6-2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nkx-6.2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nkx-6.2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NKX6-2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.