Nkx-6.1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401997-ACT

NKX6-1 codifica o fator de transcrição homeobox Nkx-6.1, um regulador-chave da padronização do endoderma pancreático e da especificação da linhagem de células β. O Nkx-6.1 coordena programas transcricionais que sustentam a diferenciação endócrina, a capacidade secretória de insulina e a manutenção da identidade das células β por meio de interações com redes centrais do desenvolvimento e de regulação gênica dirigida por enhancers. Alterações na expressão ou na função de NKX6-1 estão associadas ao prejuízo da maturação das células β e à desregulação da homeostase da glicose, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de suscetibilidade ao diabetes e de falência de células β. Como fator definidor de linhagem, NKX6-1 também é utilizado como marcador e como nó funcional na diferenciação pancreática derivada de células-tronco e em transições de estado de células das ilhotas.

Nkx-6.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NKX6-1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Nkx-6.1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NKX6-1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NKX6-1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Nkx-6.1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NKX6-1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Nkx-6.1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Nkx-6.1 em células tumorais com expressão de NKX6-1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.