Plásmido CRISPR de Activación (h) Nkx-2.2: sc-401844-ACT

NKX2-2 codifica el factor de transcripción con homeobox Nkx-2.2, un regulador nuclear que ayuda a especificar el destino celular y a mantener programas de transcripción restringidos a linajes durante el desarrollo. Se ha caracterizado principalmente en el sistema nervioso central y en el compartimento endocrino del páncreas, donde coordina la diferenciación y la maduración al integrarse con redes de homeodominios y con el control epigenético de la expresión génica. La actividad de NKX2-2 influye en procesos de patrón de desarrollo y en circuitos reguladores génicos posteriores que determinan el compromiso de los progenitores, la proliferación y la diferenciación terminal. Se ha descrito una expresión desregulada de NKX2-2 en diversos contextos patológicos asociados a estados de diferenciación alterados y a programas transcripcionales aberrantes, lo que lo convierte en un nodo útil para estudiar circuitería transcripcional del desarrollo y oncogénica.

Nkx-2.2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NKX2-2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Nkx-2.2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NKX2-2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NKX2-2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Nkx-2.2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NKX2-2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Nkx-2.2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Nkx-2.2 en células tumorales con expresión de NKX2-2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.