NKCC1 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-422971-ACT

マウスのSlc12a2は、細胞内塩化物（Cl⁻）恒常性、細胞容積の制御、ならびに上皮における液体分泌を調節する、電気的に中性なNa⁺-K⁺-2Cl⁻共輸送体であるNKCC1（SLC12A2）をコードする。細胞質Cl⁻濃度を規定することで、NKCC1はGABA作動性シグナル伝達やより広範なイオン輸送ネットワークとの相互作用を介し、膜興奮性および抑制性神経伝達に影響を与える。NKCC1活性は、浸透圧ストレス応答や分泌上皮における経上皮的な塩移動にも寄与し、神経系、肺、消化管における生理過程と結び付いている。NKCC1依存的な塩化物輸送の破綻は、神経の興奮性や気道・腸管の炎症性表現型を示すモデルと関連づけられており、疾患関連の状況におけるイオンバランスの機序研究を支持する。

NKCC1 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Slc12a2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

NKCC1 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Slc12a2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSlc12a2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性NKCC1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSlc12a2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるNKCC1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSlc12a2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるNKCC1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。