Ninein Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402270-ACT

O gene humano NIN codifica a nineína, uma proteína centrosomal de coiled-coil que se localiza no centríolo-mãe e no material pericentriolar, onde ancora as extremidades menos dos microtúbulos e ajuda a organizar arranjos de microtúbulos não centrossomais. A nineína contribui para a maturação do centrossomo, a montagem do fuso, a ciliogênese e a manutenção da polaridade celular ao coordenar, durante o ciclo celular, a dinâmica de nucleação e ancoragem de microtúbulos. Por meio dessas funções, o NIN conecta a integridade do centrossomo à fidelidade mitótica e à arquitetura do citoesqueleto, processos frequentemente alterados em distúrbios proliferativos e do neurodesenvolvimento. A alteração da função da nineína tem sido estudada no contexto de defeitos na sinalização ciliar, na migração celular e em fenótipos de instabilidade cromossômica relevantes para pesquisas sobre mecanismos de doença.

Ninein O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NIN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ninein O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NIN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NIN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ninein. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NIN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ninein no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ninein em células tumorais com expressão de NIN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.