NIF-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435958-ACT

Zfp335 kodiert das murine nukleäre Protein NIF-1, einen Transkriptionsregulator, der mit der chromatinassoziierten Kontrolle der Genexpression während der Entwicklung und der Linienfestlegung in Verbindung gebracht wird. NIF-1 wurde mit nukleären Rezeptor- und Notch-assoziierten Transkriptionsprogrammen verknüpft und unterstützt damit eine koordinierte Regulation von Proliferation und Differenzierung. In immunologischen und neuronalen Kontexten tragen Zfp335-abhängige Transkriptionsnetzwerke zu Zellschicksalsentscheidungen und zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase bei. Eine Dysregulation dieser Prozesse ist für mechanistische Untersuchungen von Entwicklungsstörungen, Immunfehlfunktionen und onkogenen transkriptionellen Zuständen relevant, ohne dabei ein klinisches Ergebnis zu implizieren.

NIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Zfp335-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Zfp335-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Zfp335-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Zfp335-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Zfp335-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.