Neuroplastin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404244-ACT

Das humane NPTN kodiert Neuroplastin, ein Zelladhäsions-Glykoprotein der Immunglobulin-Superfamilie, das an neuronalen Synapsen angereichert ist und zudem in verschiedenen nicht-neuralen Geweben exprimiert wird. Neuroplastin ist an der Bildung und Stabilisierung von Synapsen beteiligt, reguliert exzitatorische Neurotransmission und synaptische Plastizität und wirkt über eine funktionelle Kopplung an plasmalemmale Ca²⁺-ATPasen auf die Ca²⁺-Homöostase ein, wodurch nachgeschaltete calciumabhängige Signalwege beeinflusst werden. Diese Funktionen verknüpfen NPTN mit Signalwegen, die Neuritenauswachsung, aktivitätsabhängiges Remodeling neuronaler Schaltkreise und die Organisation von Membranproteinen steuern. Eine veränderte Neuroplastin-Expression oder -Signalübertragung wurde mit neuroentwicklungsbezogenen und neuropsychiatrischen Phänotypen in Verbindung gebracht; zudem wird Neuroplastin häufig im Kontext kognitionsbezogener synaptischer Dysfunktionen und zellulärer Zustandsveränderungen in Krankheitsmodellen untersucht.

Neuroplastin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPTN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neuroplastin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPTN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPTN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neuroplastin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPTN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neuroplastin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neuroplastin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPTN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.