Plasmide CRISPR d'Activation (h) nephrocystin-2: sc-403310-ACT

INVS code la néphrocystine‑2 (inversine), une protéine associée aux cils, localisée aux cils primaires et aux corps basaux, et contribuant à l’organisation du centrosome ainsi qu’à la signalisation ciliaire. La néphrocystine‑2 participe à la polarité planaire des cellules et module les sorties de la voie Wnt, en soutenant l’équilibre entre la signalisation canonique dépendante de la β‑caténine et la signalisation non canonique au cours de la morphogenèse tissulaire. L’altération d’INVS perturbe la mécanoperception dépendante des cils et la polarité épithéliale, des processus essentiels au développement et à l’homéostasie des tubules rénaux. Les variations génétiques d’INVS sont associées à des phénotypes de ciliopathies, notamment des maladies du spectre de la néphronophtise et des anomalies de latéralité, ce qui en fait une cible utile pour étudier les réseaux de signalisation pilotés par les cils dans les cellules humaines.

nephrocystin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de INVS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nephrocystin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus INVS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription INVS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nephrocystin-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus INVS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nephrocystin-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nephrocystin-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de INVS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.