Myosin Vb Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403324-ACT

MYO5B codifica a proteína motora baseada em actina miosina Vb, um regulador-chave do tráfego intracelular de membranas que coordena a dinâmica dos endossomos de reciclagem e o transporte polarizado. A miosina Vb interage com GTPases Rab para direcionar o movimento de vesículas e a entrega de cargas, sustentando a polaridade ápico-basolateral, a manutenção das junções estreitas e a reciclagem de receptores em células epiteliais. A perturbação do tráfego dependente de MYO5B desorganiza a borda em escova e a localização de proteínas de membrana, processos centrais para a homeostase do epitélio intestinal. A disfunção de MYO5B está fortemente associada a enteropatias congênitas, como a doença de inclusão de microvilosidades, e a fenótipos colestáticos relacionados, tornando-o relevante para estudos de polaridade epitelial e triagem/ordenamento endossomal.

Myosin Vb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MYO5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Myosin Vb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MYO5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MYO5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Myosin Vb. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MYO5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Myosin Vb no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Myosin Vb em células tumorais com expressão de MYO5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.