Plásmido CRISPR de Activación (h) Myosin Vb: sc-403324-ACT

MYO5B codifica la proteína motora basada en actina miosina Vb, un regulador clave del tráfico de membranas intracelulares que coordina la dinámica de los endosomas de reciclaje y el transporte polarizado. La miosina Vb interactúa con GTPasas Rab para dirigir el movimiento de vesículas y la entrega de carga, sosteniendo la polaridad apical–basolateral, el mantenimiento de las uniones estrechas y el reciclaje de receptores en células epiteliales. La alteración del tráfico dependiente de MYO5B perturba la organización del borde en cepillo y la localización de proteínas de membrana, procesos centrales para la homeostasis del epitelio intestinal. La disfunción de MYO5B se asocia fuertemente con enteropatías congénitas como la enfermedad de inclusión de microvellosidades y fenotipos colestásicos relacionados, lo que lo hace relevante para estudios de polaridad epitelial y clasificación endosomal.

Myosin Vb El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MYO5B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Myosin Vb El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MYO5B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MYO5B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Myosin Vb. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MYO5B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Myosin Vb en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Myosin Vb en células tumorales con expresión de MYO5B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.