MYL3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403198-ACT

MYL3 kodiert die Myosin-Leichtkette 3, eine regulatorische Komponente des Myosin‑II‑Motorkomplexes, die den Aktin‑Myosin‑Querbrückenzyklus und die Erzeugung kontraktiler Kraft in quergestreifter Muskulatur moduliert. Durch die Feinabstimmung der Myosin‑ATPase‑Aktivität und der Filamentinteraktionen trägt MYL3 zur Organisation des Sarkomers, zur kalziumsensitiven Kontraktilität und zur Mechanik der Myofibrillen bei. Eine veränderte MYL3‑Expression oder Varianten wurden mit kardiomyopathischen Phänotypen und einer gestörten Funktion des Herzmuskels in Verbindung gebracht, weshalb MYL3 ein nützlicher Marker für die Untersuchung der Sarkomerbiologie und kontraktilitätsassoziierter Signalwege ist. Humanes MYL3 ist daher relevant für die Erforschung der Muskelentwicklung, der Reaktionen auf mechanischen Stress und von Signalwegen, die Struktur und Leistungsfähigkeit von Kardiomyozyten steuern.

MYL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYL3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MYL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYL3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYL3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MYL3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYL3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MYL3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MYL3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYL3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.