Plasmide CRISPR d'Activation (h) MYH4: sc-400467-ACT

MYH4 code la chaîne lourde de myosine 4, un moteur contractile du muscle squelettique à contraction rapide qui s’associe à l’actine pour générer de la force via un cycle de ponts actine-myosine dépendant de l’ATP. En tant que composant central des filaments épais sarcomériques, MYH4 contribue à l’assemblage des myofibrilles, à la spécification des types de fibres et aux programmes de performance musculaire régulés par la gestion du calcium et par des réseaux de signalisation métaboliques. Bien que MYH4 soit surtout caractérisé dans la physiologie du muscle squelettique rapide, une expression altérée des isoformes de myosine et le remodelage du sarcomère sont des caractéristiques récurrentes des états pathologiques neuromusculaires et myopathiques, ce qui étaye son utilisation comme marqueur et comme nœud mécanistique dans les études de biologie musculaire. Moduler l’expression de MYH4 constitue une voie exploitable pour interroger les mécanismes qui régissent la contractilité, l’adaptation musculaire et les réponses au stress dans des modèles cellulaires humains.

MYH4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MYH4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MYH4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MYH4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MYH4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MYH4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MYH4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MYH4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MYH4 dans les cellules tumorales présentant une expression de MYH4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.