MUT CRISPR/Cas9 KOプラスミド (h2): sc-406555-KO-2

概要

MUTは、ミトコンドリアに局在するアデノシルコバラミン（ビタミンB12）依存性酵素であるメチルマロニルCoAムターゼをコードしており、L-メチルマロニルCoAをスクシニルCoAへ異性化する反応を触媒する。これにより、プロピオン酸の異化をTCA回路（クエン酸回路）へのアナプレロティックな補充流入と結び付ける。この活性は、アミノ酸（バリン、イソロイシン、メチオニン、スレオニン）および奇数鎖脂肪酸の代謝を支え、ミトコンドリアのエネルギーホメオスタシスを維持するとともに、有毒な有機酸中間体の蓄積を抑える。MUTの機能喪失変異はミトコンドリア代謝を障害し、メチルマロン酸の上昇と二次的な細胞ストレス応答を特徴とする疾患であるメチルマロン酸血症と関連する。そのためMUTの撹乱は、ミトコンドリア酵素の生物学、コバラミン依存代謝、ならびに栄養・レドックス環境の変化下における代謝リモデリングを研究するために広く用いられている。

MUT CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h2）は、human細胞株におけるMUT遺伝子の標的破壊のために設計されたプラスミドのプールです。このプールに含まれる各プラスミドは、Streptococcus pyogenes Cas9 ヌクレアーゼとともに、MUT 遺伝子座内の異なる部位を標的とする固有の sgRNA を共発現し、蛍光による同定と、トランスフェクションに成功した細胞の濃縮を可能にする GFP をコードしています。このマルチガイド戦略は、機能的なノックアウトをもたらすフレームシフトや欠失を誘導する可能性を高め、シングルガイドアプローチに代わる、より堅牢な選択肢を提供します。複数の部位で誘導された二本鎖切断（DSB）は、非相同末端結合（NHEJ）によって修復されるか、または同梱のHDRドナーテンプレートと併用した場合、遺伝子座内の定義された標的部位で相同性依存修復（HDR）によって修復されます。

RFP発現HDRドナーと併用する場合、GFPとRFPの蛍光を併用して、トランスフェクトされた細胞集団と編集された細胞集団を区別できるため、フローサイトメトリーに基づく選別およびクローン選択のワークフローが効率化されます。

相同性依存修復（HDR）ドナー — RFPレポーター付きプロマイシンカセット

確認済みで選択可能なノックアウトクローンを必要とする用途向けに、MUT HDRプラスミド（h2）には、定義されたMUTターゲット部位に特異的なホモロジーアームに挟まれた、プロマイシン耐性カセット（PuroR）および赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターを含むHDRドナー構築体が含まれています。
MUT CRISPR/Cas9 KOプラスミド（h2）と共トランスフェクションした場合：

• PuroR-RFPカセットはHDRを介してCas9切断部位に組み込まれ、MUTのオープンリーディングフレームを破壊します。
  RFP蛍光は、組み込みの成功を即座に視覚的に示す指標となり、プテロマイシン選別前または選別と並行して、蛍光に基づく編集細胞の同定や選別を可能にします。
  編集に成功した細胞はプテロマイシン耐性によって確認されるため、クローンスクリーニングの負担を大幅に軽減します。
  この選別戦略は、下流の機能解析、薬剤スクリーニング、またはモデル開発のための安定したクローン性KO細胞株の作製に最適です。

Cre-loxカセット除去システム

このHDRドナー構築体には、PuroR-RFP選択カセットを挟むloxPサイトが組み込まれており、クローンの確認後にマーカーをきれいに除去することが可能です。同梱のCreベクター：sc-418923によるCreリコンビナーゼの一過性発現により、カセットが切除され、MUT遺伝子座内に最小限の残留loxPサイトが残るだけで、下流のアッセイに対する潜在的な交絡効果が排除されます。
この2段階のアプローチ：

• 局所的なクロマチン構造および近隣の調節要素への影響を最小限に抑えます
  編集された遺伝子座において、ほぼ天然の状態に近いゲノム環境を回復させます
  同じ細胞株において、さらなる編集のためにプロマイシン選別戦略を再利用可能にします

主な特徴

• MUTの機能に不可欠なMUTエクソンを標的とするgRNA
  デリバリーを簡素化するため、SpCas9とsgRNAを単一のプラスミドから共発現
  陽性クローン選別用のプロマイシン耐性HDRドナー
  シームレスなマーカー除去のためのCreリコンビナーゼベクターを備えたloxPで挟まれたPuroRカセット
  トランスフェクションによる導入用に即使用可能な状態で提供

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。