Mer Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402654-ACT

O RYK humano (related to tyrosine kinase) codifica uma proteína do tipo receptor tirosina-quinase com atividade catalítica comprometida, que funciona como co-receptor na sinalização Wnt, particularmente nas vias Wnt não canônicas/de polaridade planar celular (PCP). Por meio de interações com o ligante WNT5A e sinais relacionados, o RYK modula a dinâmica do citoesqueleto, a polaridade celular e o comportamento migratório, influenciando o padrão de organização tecidual e programas de orientação neuronal. Alterações na expressão do RYK ou na sua saída de sinalização têm sido associadas a processos de desenvolvimento desregulados e a fenótipos relevantes para a biologia de invasão oncogênica e metástase. Essas propriedades tornam o RYK um nó útil para dissecar o “cabeamento” específico de contexto das vias Wnt e transições de estado celular em modelos de células humanas.

RYK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RYK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RYK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RYK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RYK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RYK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RYK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RYK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RYK em células tumorais com expressão de RYK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.