Plásmido CRISPR de Activación (h) MARCH5: sc-404655-ACT

MARCH5 (también conocido como MITOL) codifica una ligasa E3 de ubiquitina tipo RING localizada en la membrana externa mitocondrial, que regula la ubiquitinación y el recambio de proteínas para mantener la homeostasis mitocondrial. Al coordinar la dinámica mitocondrial, el control de calidad y la señalización, MARCH5 influye en el equilibrio entre fisión y fusión y participa en vías sensibles al estrés que se entrecruzan con la mitofagia y la apoptosis. Modula la estabilidad de proteínas mitocondriales clave implicadas en la morfología del orgánulo y la proteostasis, dando forma así a las respuestas celulares al estrés oxidativo y proteotóxico. La actividad desregulada de MARCH5 se ha vinculado a alteraciones de la función mitocondrial observadas en biología del cáncer y en fenotipos celulares asociados a la neurodegeneración, lo que lo convierte en un objetivo útil para estudios mecanísticos de redes de señalización mitocondrial.

MARCH5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MARCH5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MARCH5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MARCH5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MARCH5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MARCH5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MARCH5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MARCH5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MARCH5 en células tumorales con expresión de MARCH5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.