LRWD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405341-ACT

LRWD1 (leucinreiche Repeats und WD-Repeat-Domäne enthaltend 1), auch bekannt als ORCA, ist ein chromatinassoziierter Faktor, der über Wechselwirkungen mit Komponenten der Origin Recognition und des Prä-Replikationskomplexes an der Lizenzierung der DNA-Replikation beteiligt ist. Es trägt zu einem korrekten „Origin Firing“ und zum Fortschreiten der S-Phase bei, indem es das Laden und die Stabilisierung von Replikationsfaktoren an Replikationsursprüngen unterstützt und so den Chromatinzustand mit der Genomduplikation verknüpft. LRWD1 wurde außerdem mit der Organisation von Heterochromatin und der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität in Verbindung gebracht – Prozesse, die die Zellzykluskontrolle und Reaktionen auf Replikationsstress beeinflussen. Eine veränderte Expression oder Funktion von LRWD1 wurde in Zusammenhängen proliferativer Dysregulation beschrieben, was es für Studien zu Replikationszeitpunkten, Chromatinregulation und der Biologie von Erkrankungen im Zusammenhang mit Genominstabilität relevant macht.

LRWD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LRWD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRWD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LRWD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LRWD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRWD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LRWD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRWD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRWD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LRWD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.