LIN-28B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402851-ACT

Humanes LIN28B kodiert das RNA-bindende Protein LIN-28B, einen heterochronen Regulator, der die Reifung der let-7‑MikroRNA-Familie unterdrückt und dadurch posttranskriptionelle Genregulationsprogramme neu ausrichtet, die Proliferation, Stoffwechsel und Linienfestlegung steuern. Durch die Modulation let-7‑abhängiger Netzwerke beeinflusst LIN-28B das Entwicklungstiming, stammzellähnliche Zellzustände und die zelluläre Reprogrammierung und greift dabei in Signalwege ein, die mit den Output-Signalen von MYC, RAS/MAPK und mTOR verknüpft sind. Eine fehlregulierte LIN28B-Aktivität wurde in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten mit veränderter Differenzierung und abweichender Wachstumskontrolle in Verbindung gebracht, darunter onkogene Transkriptionsprogramme und pädiatrische Entwicklungsstörungen. Diese Eigenschaften machen LIN28B zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der miRNA-Biogenese, des RNA-Stoffwechsels und genregulatorischer Schaltkreise in menschlichen Zellen.

LIN-28B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LIN28B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LIN-28B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LIN28B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LIN28B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LIN-28B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LIN28B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LIN-28B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LIN-28B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LIN28B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.