Kindlin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412553-ACT

FERMT1 kodiert Kindlin-1, einen Adapter der Fokaladhäsion, der an die zytoplasmatischen Schwänze von Integrin‑β bindet und dadurch die Integrinaktivierung, die Zell‑Matrix‑Adhäsion und den Umbau des Aktinzytoskeletts fördert. Kindlin‑1 unterstützt die Integrität von Epithelien, die Migration von Keratinozyten und die Gewebehomöostase, indem es Integrin‑linked‑kinase‑Signalgebung, die Dynamik von Fokaladhäsionen und Mechanotransduktionswege koordiniert. Eine Störung von FERMT1 ist mit dem Kindler‑Syndrom assoziiert und wurde mit veränderter adhäsionsabhängiger Signalgebung sowie Barrierestörungen in Haut und mukosalen Epithelien in Verbindung gebracht. In Modellen der Krebsbiologie und der Wundheilung kann die Expression von Kindlin‑1 über integrinvermittelte Signalwege invasives Verhalten und Interaktionen mit der extrazellulären Matrix modulieren.

Kindlin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FERMT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Kindlin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FERMT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FERMT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Kindlin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FERMT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Kindlin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Kindlin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FERMT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.