KIF14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408805-ACT

KIF14 codifica una proteina motoria della famiglia delle chinesine che si localizza al fuso mitotico e al corpo intermedio (midbody), dove sostiene la segregazione dei cromosomi, l’organizzazione del fuso e la citocinesi. Coordina il trasporto basato sui microtubuli e interagisce con i regolatori del fuso centrale per garantire una corretta abscissione e la progressione del ciclo cellulare. Un’espressione deregolata di KIF14 è frequentemente associata a fenotipi proliferativi e instabilità cromosomica, collegandola a vie che governano la fedeltà mitotica e il mantenimento del genoma. Di conseguenza, KIF14 è spesso studiata in modelli di controllo della divisione cellulare, aneuploidia e biologia tumorale per comprendere come un’attività alterata delle chinesine rimodelli gli esiti della mitosi.

KIF14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KIF14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIF14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KIF14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KIF14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIF14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KIF14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIF14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIF14 nelle cellule tumorali con espressione di KIF14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.