KCC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405294-ACT

O gene humano **SLC12A4** codifica o cotransportador K+-Cl− **KCC1**, um transportador de membrana eletroneutro que medeia o efluxo acoplado de potássio e cloreto para regular a concentração intracelular de cloreto, o volume celular e a homeostase osmótica. A atividade do KCC1 influencia gradientes eletroquímicos que moldam o potencial de membrana e a sinalização dependente de cloreto, interagindo com redes de transporte iônico controladas pelas vias de quinases WNK-SPAK/OSR1 e por respostas reguladas por volume. Por meio de seu papel na manutenção do equilíbrio iônico, o KCC1 contribui para processos como proliferação, sensibilidade à apoptose e estado de hidratação celular em múltiplos tecidos. A desregulação do transporte de cátions e cloreto tem sido implicada em estados patológicos nos quais o controle de volume e o manejo de cloreto estão alterados, sustentando o uso de **SLC12A4** como um nó mecanístico em estudos de biologia de transportadores e adaptação ao estresse.

KCC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC12A4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KCC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC12A4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC12A4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KCC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC12A4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KCC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KCC1 em células tumorais com expressão de SLC12A4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.