IRAK-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400264-ACT

IRAK1 kodiert die Interleukin‑1‑Rezeptor‑assoziierte Kinase 1 (IRAK‑1), eine Serin/Threonin‑Kinase, die die Aktivierung von Toll‑like‑Rezeptoren und des IL‑1‑Rezeptors mit nachgeschalteten Signalwegen der angeborenen Immunantwort koppelt. Nach der Rezeptoraktivierung ist IRAK‑1 an der MyD88‑abhängigen Komplexbildung und an Phosphorylierungsereignissen beteiligt, die die Aktivierung von TRAF6 fördern und dadurch Signalübertragung über die NF‑κB‑ und MAPK‑Signalwege sowie die Transkription entzündlicher Mediatoren auslösen. Dieser Knotenpunkt beeinflusst die Zytokinproduktion, die Aktivierung von Immunzellen und das Zusammenspiel mit interferonregulierten Programmen. Eine fehlregulierte IRAK‑1‑Aktivität und ein veränderter Signalfluss in diesem Signalweg wurden mit aberranter Entzündungssignalgebung in zahlreichen immunvermittelten Erkrankungen und bei tumorassoziierter Inflammation in Verbindung gebracht, was mechanistische Untersuchungen in relevanten Zellmodellen motiviert.

IRAK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRAK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRAK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRAK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRAK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRAK-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRAK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRAK-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRAK-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRAK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.