Int-6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405759-ACT

Humanes EIF3E (Int-6) kodiert eine konservierte Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor‑3‑(eIF3)-Komplexes, unterstützt die cap‑abhängige Initiation der Translation und koordiniert die Rekrutierung von mRNA an die 40S‑ribosomale Untereinheit. Über die Kontrolle der Translation hinaus wird Int‑6 mit Proteostase und Signaltransduktion in Verbindung gebracht, und zwar über Interaktionen, die die Proteinsynthese mit der Dynamik des Ubiquitin‑Proteasom‑Systems und stressresponsiven Programmen koppeln. Die EIF3E‑Aktivität beeinflusst Zellzyklusprogression, Differenzierung und adaptive Antworten auf zellulären Stress und ist damit relevant für Studien zur translationalen Reprogrammierung. Eine Fehlregulation der EIF3E‑Expression oder des Gleichgewichts des eIF3‑Komplexes wurde mit veränderter Wachstumskontrolle und onkogenen Signalgebungskontexten assoziiert, was mechanistische Forschung in der Krebsbiologie und verwandten Pathologien motiviert.

Int-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF3E-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Int-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF3E-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF3E-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Int-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF3E-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Int-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Int-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF3E-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.