Plasmide CRISPR d'Activation (h) INCENP: sc-403186-ACT

INCENP (inner centromere protein) est un composant central du complexe passager chromosomique, qui coordonne l’alignement des chromosomes en mitose, la signalisation du point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique et la cytocinèse. Grâce à son couplage fonctionnel avec la kinase Aurora B, la survivine (BIRC5) et la boréaline (CDCA8), INCENP contribue à réguler les attachements kinétochore–microtubule, la phosphorylation de l’histone H3 et la correction des interactions erronées avec le fuseau. Une activité correcte d’INCENP est donc essentielle pour une ségrégation fidèle des chromosomes et le maintien de la stabilité génomique lors de la division cellulaire. Une dérégulation de la signalisation du complexe passager chromosomique est associée à l’aneuploïdie et à des phénotypes prolifératifs pertinents en cancérologie et dans d’autres contextes d’instabilité chromosomique.

INCENP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de INCENP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

INCENP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus INCENP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription INCENP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de INCENP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus INCENP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de INCENP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie INCENP dans les cellules tumorales présentant une expression de INCENP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.