ILDR1 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-430649-ACT-2

Das Mausgen Ildr1 kodiert den immunoglobulinähnlichen Domänenrezeptor 1 (ILDR1), ein Transmembranprotein mit einer einzigen Membranspanne, das an trikellulären Tight Junctions angereichert ist, wo es zur Organisation der Architektur epithelialer Barrieren beiträgt und die parazelluläre Permeabilität reguliert. ILDR1 ist an der Assemblierung von Zellkontakten sowie an Signalprozessen beteiligt, die mit apikobasaler Polarität und dem Transport von Membranproteinen verknüpft sind, und unterstützt dadurch eine koordinierte Zell-Zell-Adhäsion in sensorischen und epithelialen Geweben. Eine Störung der ILDR1-Funktion wird mit Tight-Junction-Defekten und auditiver Pathophysiologie in Verbindung gebracht, wodurch Ildr1 ein relevantes Ziel für die Untersuchung von Mechanismen des Hörverlusts und von Störungen der epithelialen Barrierefunktion darstellt. Die Geneditierung von Ildr1 in der Maus ermöglicht in vivo und in vitro die Analyse der Biologie trikellulärer Zellkontakte, der gewebespezifischen Barriere-Regulation sowie nachgeschalteter transkriptomischer oder proteomischer Veränderungen in Modellen der Entwicklung sensorischer Epithelien und krankheitsrelevanter Stressantworten.

ILDR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ildr1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ILDR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ildr1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ildr1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ILDR1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ildr1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ILDR1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ILDR1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ildr1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.