HVEM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402104-ACT

TNFRSF14 kodiert HVEM (Herpesvirus-Entry-Mediator), ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das an der Zelloberfläche stimulierende und inhibitorische Immunsignale integriert. HVEM bindet mehrere Liganden, darunter LIGHT (TNFSF14), BTLA und CD160, und moduliert dadurch NF-κB- und MAPK-assoziierte Transkriptionsprogramme, die die T‑Zell-Aktivierung, die Zytokinproduktion und die Immunhomöostase prägen. Durch Crosstalk mit kostimulatorischen und Checkpoint-Signalwegen trägt HVEM zur Regulation des Lymphozyten-Traffickings und entzündlicher Antworten in unterschiedlichen Gewebekontexten bei. Eine fehlregulierte HVEM-Signalübertragung wurde mit immunvermittelten Entzündungen und Tumor–Immun-Interaktionen in Verbindung gebracht, was HVEM zu einem geeigneten Knotenpunkt für mechanistische Studien der Immunregulation und der Signalgebung im Mikromilieu macht.

HVEM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HVEM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HVEM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HVEM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HVEM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.