H⁺/K⁺ ATPase β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403057-ACT

ATP4B codifica a subunidade β da H+/K+ ATPase gástrica, uma ATPase do tipo P heterodimérica necessária para a montagem, o direcionamento à membrana e a estabilidade funcional da bomba de prótons nas células parietais. Ao sustentar a secreção de H+ em troca de K+, a ATP4B contribui para a acidificação gástrica, a homeostase iônica do epitélio e processos digestivos dependentes de pH. A regulação da expressão de ATP4B se cruza com vias que governam a diferenciação epitelial, o tráfego de membranas e a organização dos canalículos secretores. Alterações na expressão e no reconhecimento imune de componentes da H+/K+ ATPase gástrica foram associadas à disfunção da mucosa gástrica e a fenótipos de gastrite associada à autoimunidade, tornando a ATP4B um marcador útil e um nó mecanístico na pesquisa em biologia do estômago.

H+/K+ ATPase β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP4B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

H+/K+ ATPase β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP4B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP4B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de H+/K+ ATPase β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP4B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de H+/K+ ATPase β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via H+/K+ ATPase β em células tumorais com expressão de ATP4B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.