H⁺/K⁺ ATPase β CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403057-ACT

ATP4Bは、胃のH⁺/K⁺ ATPアーゼ（ヘテロ二量体のP型ATPアーゼ）を構成するβサブユニットをコードしており、壁細胞におけるプロトンポンプの組み立て、膜への局在化、ならびに機能的安定性に必須です。ATP4Bは、K⁺との交換によるH⁺分泌を支えることで、胃内の酸性化、上皮のイオン恒常性、そしてpH依存的な消化過程に寄与します。ATP4B発現の制御は、上皮分化、膜輸送、分泌細管（secretory canaliculus）の構築を司る経路と交差しています。胃H⁺/K⁺ ATPアーゼ構成要素の発現異常や免疫学的認識は、胃粘膜機能障害や自己免疫関連の胃炎表現型と関連づけられており、ATP4Bは胃の生物学研究における有用なマーカーであると同時に、機構理解の要となる分子です。

H+/K+ ATPase β CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ATP4Bの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

H+/K+ ATPase β CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ATP4B 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はATP4B転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性H+/K+ ATPase βの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のATP4B遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるH+/K+ ATPase β依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびATP4B発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるH+/K+ ATPase β経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。