HSPA5/BiP/GRP78 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420699-ACT

O gene Hspa5 do camundongo codifica a HSPA5 (BiP/GRP78), uma chaperona da família HSP70 do retículo endoplasmático (RE) que se liga a polipeptídeos nascentes, auxilia no dobramento e na montagem de proteínas e regula a homeostase de Ca²⁺ no RE. A HSPA5 é um sensor e efetor central da resposta a proteínas mal dobradas (UPR), coordenando a sinalização de estresse do RE por meio de PERK–EIF2α, IRE1–XBP1 e ATF6 para restaurar a proteostase ou acionar a apoptose sob estresse persistente. Por meio de seus papéis na degradação associada ao RE (ERAD), na maturação da via secretora e no controle de qualidade, a HSPA5 influencia o metabolismo celular, o equilíbrio redox e a sinalização inflamatória. A desregulação da atividade de HSPA5/UPR é amplamente estudada em contextos como neurodegeneração, estresse metabólico e biologia tumoral, nos quais a proteostase alterada e a adaptação ao estresse do RE moldam a sobrevivência celular e as interações imunes.

HSPA5/BiP/GRP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hspa5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSPA5/BiP/GRP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hspa5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hspa5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSPA5/BiP/GRP78. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hspa5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSPA5/BiP/GRP78 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSPA5/BiP/GRP78 em células tumorais com expressão de Hspa5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.