Plásmido CRISPR de Activación (h) hamartin: sc-402444-ACT

El TSC1 humano codifica hamartina, una proteína andamiaje que forma un complejo funcional con TSC2 (tuberina) para actuar como regulador activador de GTPasa de RHEB y restringir la señalización de mTORC1. A través de este eje, la hamartina integra señales de factores de crecimiento y del estado energético para controlar la síntesis de proteínas, la autofagia, el crecimiento celular y la homeostasis metabólica. La alteración del control de mTORC1 mediado por TSC1 perturba los programas de tamaño celular y proliferación y modifica las respuestas al estrés. La variación genética en TSC1 se asocia con la biología relacionada con el complejo de esclerosis tuberosa y se estudia ampliamente en modelos de señalización desregulada de la vía de mTOR.

hamartin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TSC1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

hamartin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TSC1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TSC1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de hamartin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TSC1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de hamartin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía hamartin en células tumorales con expresión de TSC1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.