HAH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404870-ACT

ATOX1 codifica a HAH1, uma chaperona citosólica de cobre que se liga a Cu(I) e o entrega às ATPases do tipo P ATP7A/ATP7B na via secretória, apoiando a metalação de cuproenzimas e a manutenção da homeostase celular do cobre. Por meio dessas etapas de tráfego, ATOX1 influencia o equilíbrio redox, a função mitocondrial e as respostas ao estresse oxidativo, podendo também modular indiretamente redes de sinalização ligadas à proliferação e à migração. A desregulação do manuseio de cobre e alterações na atividade de ATOX1 têm sido associadas a fenótipos neurodegenerativos e metabólicos, e são frequentemente investigadas no contexto da biologia tumoral dependente de cobre e do estresse inflamatório. Como a disponibilidade de cobre molda a atividade enzimática e programas transcricionais, ATOX1 é amplamente estudada em vias que governam o transporte de metais, a maturação de proteínas e a adaptação celular a condições oxidativas.

HAH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATOX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HAH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATOX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATOX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HAH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATOX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HAH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HAH1 em células tumorais com expressão de ATOX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.