Plásmido CRISPR de Activación (h) GS1: sc-405996-ACT

La PUDP humana (pseudouridina 5′-fosfatasa), también denominada GS1, es una enzima citosólica de la red de rescate de pirimidinas que desfosforila la pseudouridina 5′-monofosfato para generar pseudouridina, lo que favorece el recambio y el reciclaje de nucleósidos modificados derivados del catabolismo del ARN. Al regular los niveles de nucleótidos de pseudouridina, PUDP influye en la homeostasis de nucleótidos e interseca con vías que gobiernan la dinámica de las modificaciones del ARN, el metabolismo de ribonucleótidos y las respuestas celulares al estrés metabólico. La alteración en el manejo de nucleósidos modificados se vincula cada vez más con el recambio desregulado de ARN y la reprogramación metabólica observados en diversos contextos de enfermedad, lo que convierte a PUDP en un nodo útil para estudios mecanísticos. La modulación de la expresión de PUDP/GS1 permite investigar cómo el metabolismo de la pseudouridina afecta a los programas de expresión génica y a la fisiología celular.

GS1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PUDP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GS1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PUDP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PUDP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GS1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PUDP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GS1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GS1 en células tumorales con expresión de PUDP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.