Plasmide CRISPR d'Activation (m) GRP94: sc-423491-ACT

La protéine murine Hsp90b1 code GRP94 (gp96), un chaperon de la famille HSP90 résident du réticulum endoplasmique (RE) qui soutient le repliement des protéines, le contrôle qualité et l’homéostasie du RE. GRP94 est indispensable à la maturation et au trafic de certaines protéines sécrétées et membranaires, notamment les intégrines et les récepteurs Toll-like, influençant ainsi l’adhésion cellulaire, la signalisation de l’immunité innée et les voies médiées par les récepteurs. Son activité est étroitement couplée à la signalisation du stress du RE et à la réponse aux protéines mal repliées (UPR), reliant la régulation de Hsp90b1 à la protéostasie, à l’inflammation et à l’adaptation cellulaire au stress. Un dysfonctionnement de GRP94 a été associé à des phénotypes immunitaires altérés, à une biologie perturbée de la voie sécrétoire et à des réponses au stress pertinentes pour la maladie dans des modèles de cancer et de dysfonctionnement métabolique.

GRP94 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hsp90b1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRP94 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hsp90b1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hsp90b1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRP94. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hsp90b1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRP94 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRP94 dans les cellules tumorales présentant une expression de Hsp90b1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.