Plasmide CRISPR d'Activation (m) GRP: sc-432553-ACT

Le gène murin *Grp* code le peptide de libération de la gastrine (GRP), un neuropeptide qui signale principalement via le récepteur du GRP (GRPR) afin de réguler les flux intracellulaires de calcium, la signalisation MAPK/ERK et les voies liées à l’AMPc. Le GRP contribue à la communication neuroendocrine et module des processus tels que l’activité sécrétoire gastro-intestinale, la contractilité du muscle lisse et des comportements du système nerveux central comme l’alimentation et les réponses au stress. Dans les tissus périphériques et les tumeurs, la signalisation GRP–GRPR a été associée à des programmes mitogènes et inflammatoires qui interagissent avec des réseaux de signalisation des facteurs de croissance. Une signalisation GRP dérégulée est donc fréquemment étudiée dans des modèles de régulation neuroendocrine, de physiologie gastro-intestinale et d’activation de voies oncogéniques.

GRP Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Grp sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRP Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Grp dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Grp, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Grp natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRP dans les cellules tumorales présentant une expression de Grp silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.