GRK 4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402816-ACT

Humanes GRK4 (G‑Protein‑gekoppelte Rezeptorkinase 4) ist eine Serin/Threonin‑Kinase, die aktivierte GPCRs phosphoryliert und dadurch eine Rezeptordesensibilisierung und Internalisierung über β‑Arrestin‑abhängige Mechanismen fördert. Es wird besonders in dopaminergen und renalen Signalzusammenhängen untersucht, wo es die Rezeptorantwort und nachgeschaltete Second‑Messenger‑Signalwege wie cAMP/PKA modulieren kann. Die GRK4‑Aktivität beeinflusst die Beendigung zellulärer Signale, das Rezeptor‑Trafficking sowie adaptive Umprogrammierungen der Signalübertragung, die die Homöostase membranständiger Rezeptoren prägen. Genetische Variationen und eine veränderte Expression von GRK4 wurden im Zusammenhang mit kardiometabolischen und renalen Phänotypen untersucht, was seine Relevanz für mechanistische Studien der GPCR‑getriebenen Krankheitsbiologie unterstreicht.

GRK 4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRK 4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRK 4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRK 4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRK 4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.