GRIF-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-427813-ACT-2

O gene murino Trak2 codifica a GRIF-1, um adaptador de tráfego que conecta cargas aos motores de cinesina para sustentar o transporte de organelos e vesículas a longas distâncias, dependente de microtúbulos, com papéis de destaque em compartimentos neuronais e sinápticos. A GRIF-1 participa no posicionamento de mitocôndrias e de outras cargas ao longo de axónios e dendritos, influenciando a distribuição de energia, a regulação do cálcio e a sinalização dependente da atividade em vias que controlam a manutenção de neuritos e a função sináptica. A perturbação do transporte mediado por TRAK2 está associada a fenótipos celulares relevantes para a neurodegeneração e para disfunções do neurodesenvolvimento, em que a dinâmica organelar e o tráfego axonal comprometidos contribuem para a vulnerabilidade neuronal. Ferramentas de investigação para Trak2/GRIF-1 permitem estudos mecanísticos do transporte intracelular, da motilidade mitocondrial e do tráfego de cargas específico de neurónios, incluindo a análise de vias em modelos genéticos e em ensaios baseados em células.

GRIF-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Trak2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GRIF-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Trak2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Trak2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GRIF-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Trak2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GRIF-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GRIF-1 em células tumorais com expressão de Trak2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.