Plásmido CRISPR de Activación (h) GPR105: sc-405954-ACT

P2RY14 codifica el receptor purinérgico humano GPR105, un GPCR que responde a UDP-azúcares extracelulares como la UDP-glucosa y se acopla a la señalización Gi/o para modular el AMPc intracelular y los programas inflamatorios posteriores. La actividad de GPR105 influye en la quimiotaxis de leucocitos y en la producción de citocinas, conectando la detección de nucleótido-azúcares con la regulación de la inmunidad innata en compartimentos mieloides y epiteliales. Este receptor interactúa con redes de señalización de quimiocinas y purinérgicas que modelan la inflamación tisular y las respuestas de barrera. La señalización alterada de P2RY14/GPR105 se ha asociado con desregulación inmunitaria y fisiopatología relacionada con la inflamación, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos de procesos patológicos impulsados por el microambiente.

GPR105 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de P2RY14 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GPR105 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus P2RY14 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional P2RY14, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GPR105. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo P2RY14 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GPR105 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GPR105 en células tumorales con expresión de P2RY14 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.